淋巴瘤是一组起源于淋巴结或其他淋巴组织的恶性肿瘤，有霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma, HL) 和非霍奇金淋巴瘤之分。霍奇金淋巴瘤占所有恶性淋巴瘤 15%～20%，大约 90%～95%的 HL 为经典型霍奇金淋巴瘤(clsssic Hodgkin lymphoma, CHL)，其余为结节性淋巴细胞为主霍奇金淋巴瘤。霍奇金淋巴瘤的预 后与临床分期紧密相关，发展到第Ⅳ期有 2%～32%侵犯骨髓，即淋巴瘤骨髓浸润[1-3]。本研究对近些年收集的20例霍奇金淋巴瘤累及骨髓病例进行分析，将骨髓活检和免疫组化（immunohistochemistry，IHC）结果与骨髓细胞形态学和流式细胞学检测结果相对比，提高对此类疾病病理诊断的认识。

1.1 资料

1.1.1 病例与标本

收集北京海思特医学检验实验室病理科 2019 年 8 月至 2021 年 5 月间已确诊的霍奇金 淋巴瘤累及骨髓患者 20 例，男 16 例，女 4 例；年龄 28～78 岁，中位年龄 55 岁。

1.1.2 免疫组织化学试剂 

免疫组化所用一抗抗体 CD3、CD5、CD15、CD20、Pax-5、CD30、LCA、MUM1、OCT2、 BOB1、Ki-67 均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。Pax-5、Ki-67、MUM1、OCT2 阳性信号定位于细胞核, CD3、CD15、CD30 阳性信号定位于细胞膜/质, CD5、CD20、LCA 阳性信号定位于细胞膜，BOB1 阳性信号定位于细胞核/质。

1.2 方法

1.2.1 骨髓活检

理想的骨髓活检取材要求长度≥1.5 cm，足够多观察区域才能保证诊断的正确性，因此 应包含 10 个左右骨小梁区域；合格的骨髓活检长度≥1.0 cm ，至少包括 5～6 个骨小梁区域[4]。为提高 诊断检出率，如有必要可以多部位或左右双侧髂骨取材送检。所选患者骨髓活检取材长度均≥1.0 cm，直 径 0.2 cm。长度≤1.0 cm，难以客观反映骨髓增生程度，对骨髓病理诊断有局限性，视为不达标标本。 髂前或髂后上棘骨髓环钻活检标本（长度≥1.0 cm）常规制片包括 HE 染色、Gomori 网状纤维染色。骨髓 组织经 4%中性甲醛溶液固定 8 h；采用本室常规脱钙 SOP，8%盐酸甲醛溶液脱钙 30 min，此方法脱钙时间短，标本脱钙后对后续 HE 染色、特殊染色、免疫组化没有影响[5-6]。

再经乙醇梯度脱水，进行石蜡包埋，切片厚度为 4μm，常规 HE 染色后镜检。骨髓活检光镜观察主要 包括以下 4 个方面:①浸润模式:淋巴瘤累及骨髓的浸润模式包括结节型(小梁旁、小梁间)、间质型、弥漫 型、窦内型[7]；②骨髓增生程度:采用五级划分法，分为增生极度减低(＜20%)、增生减低(21%～40%)、活 跃(41%～60%)、明显活跃(61%～80%)、极度活跃(81%～100%)；③网状纤维增生情况评估，分级方法采用 欧洲骨髓纤维化提出的 4 级分级法，即:0、1、2、3 级 [8]。

1.2.2 免疫组化

免疫组化采用于 Thermo 自动免疫组化染色仪进行 EnVision 两步法染色。石蜡切片首先 进行脱蜡和水化，然后进行抗原修复，随后加入内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育后用 PBS 缓冲液冲洗。 滴加适量的一抗，孵育 1 h 后用 PBS 缓冲液冲洗。滴加反应增强液后室温孵育，用 PBS 缓冲液冲洗。滴加 增强酶标山羊抗小鼠/兔 IgG 聚合物室温孵育后用 PBS 缓冲液冲洗。加入新鲜配置的显色液室温孵育，用 自来水冲洗后用苏木素染色液复染，在光学显微镜下进行结果判读。

1.2.3 显色原位杂交

将石蜡切片按照 EBER 检测试剂盒（原位杂交法）说明进行操作处理，对染色后的 组织片在光学显微镜下观察并进行判读。

1.2.4 骨髓细胞形态学检查

抽取骨髓液 0.2 ml，迅速涂片 4~5 张，另制备外周血涂片 2 张，干燥后瑞 氏染色，镜检。

1.2.5 流式细胞学

抽取骨髓液 2 ml，采用肝素抗凝，用八色法多参数流式细胞仪 BD FACSCanto II 进行 流式细胞免疫分型，以 CD45/SSC、CD45-CD30 双重设门分析，以异常细胞抗原表达比例≥20%为阳性。结果 以 BD Diva 软件进行分析。

2.1 临床特点

20 例霍奇金淋巴瘤中，男 16 例，女 4 例；年龄 28~78 岁，中位年龄 55 岁。患者以低热、 外周血三系减少、淋巴结肿大、贫血、肝脾肿大等多见。

2.2 骨髓细胞形态学特征

 20 例样本中，骨髓细胞形态学检测见单个核（H）和双核(R-S)细胞 0 例，其中 10 例结果提示为正常骨髓，4 例结果提示为骨髓纤维化，6 例结果提示可见个别异型淋巴细胞。骨髓细胞 形态学结果可以看到涂片中比正常骨髓涂片比例偏高的背景细胞包括：嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、组 织细胞，均未见明显巨大核仁的单个核（H）和双核(R-S)异常细胞(图 1A，1B)。其中 4 例骨髓干抽，有核 细胞较少，可见明显的“泪滴”样红细胞，骨髓细胞形态学提示骨髓纤维化。6 例部分干抽，粒系早幼粒细 胞比例正常，余各阶段少见，形态大致正常；嗜酸性细胞、嗜碱性细胞比例稍高，形态正常；红系中、晚 幼红细胞比例减低，形态大致正常；成熟红细胞形态正常；淋巴细胞比例明显增高，可见个别异型淋巴细 胞；单核细胞比例、形态正常；巨核细胞及血小板不少，骨髓细胞形态学提示骨髓部分稀释，结果仅供临 床参考。10 例有核细胞增生活跃；粒系增生活跃，粒系各阶段细胞比例、形态大致正常；嗜酸性细胞、嗜 碱性细胞比例稍高，形态正常；红系各阶段细胞比例、形态大致正常。成熟红细胞形态正常；淋巴细胞比 例及形态正常；单核细胞比例形态正常；巨核细胞及血小板不少；骨髓细胞形态学提示正常增生性骨髓像 改变。

2.3 流式细胞学免疫分型

20 例患者骨髓标本流式检测结果，均未见明显异常表型细胞。在 CD45/SSC 点 图上设门分析，嗜酸性粒细胞（图示天蓝色）占有核细胞的 6.4%，比例增高，其表型未见明显异常。在 CD45- CD30 点图上设门分析，不表达 CD15、CD19、CD20、CD30，未发现明显异常的霍奇金淋巴瘤肿瘤细胞(图 2A，2B)。

2.4 骨髓活检

镜下组织形态学显示，在 20 例患者样本中均可见骨髓小梁间区有核造血细胞粒、红、巨 核三系及纤维组织多灶性增生(图 3A)，在增生纤维组织间散在或多、或少，有明确红核仁的单个核（H 细 胞），双核（R-S 细胞）大细胞，以单个核细胞多见(图 3B)。周边散在多量小淋巴细胞、浆细胞、嗜酸细 胞、组织细胞等背景细胞浸润，浸润方式以结节性及肉芽肿样结构为主，少见弥漫性浸润。在 20 例阳性骨 髓标本中，17 例（85%）病变区内可诊断出明显的单个核的 H 变异型细胞，13 例（65%）病变区可检出明显的 H 变异型细胞及 R-S 细胞，基本所有背景表现为混合性炎性反应。

2.5 Gomori 网状纤维染色

20 例患者网银染色显示: MF-1 级 10 例（占比 50%）、MF-2 级 6 例（占比 30%）、MF-3 级 4 例（占比 20%）。骨髓标本中，有 1 例骨髓增生低下（占比 5%）、10 例增生活跃（占比 50%）、4 例骨髓增生明显活跃（占比 20%）、1 例骨髓增生极度活跃（占比 5%）、4 例完全骨髓纤维化（占 比 20%）。

2.6.免疫组化

免疫组化结果显示在 20 例患者样本 CD3(-)(20/20)、CD5(-)(20/20)、CD15(+)(3/20)、 CD20(+)(5/20)、CD30(+)(20/20)、LCA(-)(20/20)、MUM1(+)(20/20)、Ki-67(+)(20/20)、Pax-5(+)(20/20)、 OCT2(+)(4/20)、BOB1(+)(3/20)、EBV-EBER(+) (8/20)。

HL 是单克隆 B 细胞肿瘤，组织形态学中可见大量造血组织细胞、小淋巴细胞及组织细胞反应性炎性背 景中的少数散在体积大的单个核和多核肿瘤性 B 细胞（H/R-S 细胞）。20 例患者骨髓活检样本 H/R-S 细胞 蛋白水平均表达 CD30、MUM1、PAX5，其中 5 例表达 CD20，4 例表达 OCT2，3 例表达 BOB1(图 4A，4B)。

2.7 EBV-EBER 原位杂交

20 例患者骨髓活检样本中 EBV-EBER 原位杂交显示有 8 例阳性(图 4C)。

2012 年李小秋等发表中国淋巴瘤亚型分布多中心统计 10 002 例病例，显示 HL（854 例）占全部淋巴瘤的 8.54%；2020 年中国新发 6 829 例 HL，男性多于女性[9-10]。我国 90%的 HL 以淋巴结肿大为首发症状， 以颈部淋巴结和锁骨上淋巴结常见，后浸润其他淋巴结，晚期可侵犯血管，累及脾、肝、骨髓和消化道等。 2005 David Viswanatha MD 报道 HL 侵犯骨髓的发生率约为 3%~15%；另有报道霍奇金淋巴瘤发展到第Ⅳ 期有 2%～32%侵犯骨髓[11-12]。预后评价主要分为局限期预后评分和进展期预后评分。进展期主要采用国际 预后评分（IPS） [2]。

3.1 霍奇金淋巴瘤累及骨髓镜下诊断

霍奇金淋巴瘤累及骨髓患者往往伴有低热、外周血一系或三系降低， 可以侵犯多个结外器官，如骨髓、肝脏等器官受累。霍奇金淋巴瘤累及骨髓的取材部位，血液科医师根据 患者情况可以选择 X 线监视下骨质破坏处病灶活检，或者髂前或髂后上棘骨髓穿刺活检。骨髓活检霍奇金 淋巴瘤累及骨髓一般有复杂的炎性背景，同时多伴有骨髓纤维化，导致流式细胞学及骨髓细胞形态学涂片 难以获得足够的肿瘤细胞。本组一共 20 例霍奇金淋巴瘤累及骨髓患者样本，通过骨髓活检和免疫组化可检 测到异常存在的 H/R-S 细胞进行诊断确定，但流式细胞学和骨髓细胞形态学均未检测 H/R-S 细胞。

3.1.1 骨髓活检是对完整的骨髓组织进行观察

能够更好的显示出骨髓造血情况的好坏，更能准确反映淋 巴瘤骨髓浸润情况，且能避免骨髓细胞学干抽、外周血稀释的影响，将骨髓活检与骨髓涂片相结合对淋巴 瘤诊断和分期具有重要意义[13-14]。通过骨髓活检结合免疫组化在 20 例（100%）患者的病变区内可检出明确 H/R-S 细胞。诊断 HL 常规检测的 IHC 标记物包括 CD3、CD5、CD20、Pax-5、CD15、CD30、LCA、MUM1 和 Ki- 67。CHL 常表现为 CD3(-)、CD5(-)、CD20(-/+)、Pax-5(+)、CD15(+/-)、CD30(+)、LCA（-）MUM1(+)、BOB1(-)、 OCT2(-/+)。本研究中所列的20 例标本的免疫组化结果与此基本一致，表现为 Pax-5(+)、CD15(+/-)、CD30(+)、 MUM1(+)、LCA（-）。

3.1.2 累及骨髓的霍奇金患者骨髓细胞形态学检查一般显示骨髓有核细胞增生活跃

部分病例可见反应性 细胞如嗜酸粒细胞、嗜碱性粒细胞、组织细胞等增多，单核细胞也可轻度增生。由于骨髓纤维化，骨髓细 胞形态学常常出现干抽或部分稀释现象，通常在细胞形态学涂片中很难找到 H/R-S 细胞，如果仅通过骨髓 细胞形态学检查，往往会造成漏诊。在少数情况下如骨髓滚片或印片，有可能检出对 HL 有诊断意义的特异 性 H/R-S 细胞[15]；但骨髓细胞涂片找到 H/R-S 细胞阳性率较低，仅 3%左右,骨髓活检可提高到 9%～22%[6]。 本组所收集的 20 例霍奇金淋巴瘤累及骨髓病例，在骨髓活检之前或者同时进行的骨髓细胞形态学检测，20 例患者均没有看到明确的 H/R-S 细胞，本组所收集的病例有限，因而与其他学者的研究结果略有差别。其中有 4 例干抽，6 例部分干抽并且细胞数量少，有 10 例正常骨髓形态，20 例样本均未见明确的 H 或 R-S 细 胞。

3.1.3 流式细胞学在淋巴瘤累及骨髓检测灵敏度、准确性高

同时亦可作为治疗后治疗效果评判依据，在 淋巴瘤累及骨髓诊断中是不可或缺的重要检测手段，特别是在 B 细胞淋巴瘤诊断中价值更大。霍奇金淋巴 瘤评估是否骨髓累及时，因为肿瘤细胞含量低，骨髓累及时常常伴有纤维化，骨髓穿刺液难以获取霍奇金 淋巴瘤细胞，故绝大部分骨髓流式细胞学检测是假阴性。霍奇金淋巴瘤细胞表达 CD15、CD30、CD40、CD71、 CD86、CD95，CD45 弱阳性，SSC 较大。部分霍奇金淋巴瘤 PAX-5 阴性，故有时与介于弥漫大 B 细胞淋巴瘤 和经典霍奇金淋巴瘤之间不能分类型难以鉴别，但在流式中可以采用 CD40、SSC、CD45 荧光强度、瘤细胞 数量及克隆性的表达进行区分。流式细胞学对 B 淋巴瘤细胞进行 Kappa、Lambda 比值定量分析，对 B 淋巴 细胞单克隆性评判，在 B 细胞淋巴瘤累及骨髓及治疗后评判更有优势。但对于此 20 例霍奇金淋巴瘤患者 骨髓标本，流式检测结果均未见异常 B 淋巴细胞，Kappa/Lambda 比值正常，未见单克隆性 B 淋巴细胞增生， 部分病例可见嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞比例稍高外，均未见明显异常的表型细胞。这与霍奇金肿瘤细 胞的浸润细胞数量及方式有很大的关系，诊断价值远低于其在非霍奇金淋巴瘤中的价值。

3.2 鉴别诊断

3.2.1 HL 累及骨髓往往伴有骨髓纤维化 需与原发性骨髓纤维化鉴别。

原发性骨髓纤维化（primary myelofibrosis，PMF）骨髓活检特点为粒系和巨核系过度增殖，粒系可有轻度核左移，巨核系易见簇状或 片状分布，巨核细胞形态明显异常，多数胞体大，核质比例失调，核呈球形、云朵样或气球形，可见裸巨 核 [16]。免疫组化 CD61 和 CD42b 可以辅助鉴别巨核细胞。

3.2.2 HL 淋巴瘤累及骨髓常伴有多量反应性 T 淋巴细胞增生

需与外周 T 细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞 性 T 细胞淋巴瘤、富于 T 细胞/组织细胞的大 B 细胞淋巴瘤、CD30 阳性的大 B 细胞淋巴瘤相鉴别。

非特殊类型外周 T 细胞淋巴瘤（peripheral T-cell lymphoma, not otherwise, PTCL, NOS）异常增 生的 T 淋巴细胞，其中可见透明细胞和 R-S 样细胞，同时伴有炎性背景，异常增生的淋巴细胞会出现 T 细 胞抗原表达异常，如 CD5 和 CD7 表达缺失[17-18]。血管免疫母细胞性 T 细胞淋巴瘤（angioimmunoblastic Tcell lymphoma, AITL）部分可见 R-S 细胞样 EBV 阳性的 B 细胞，此时和 CHL 类似，肿瘤性 T 细胞往往出 现抗原表达丢失[19]。富于 T 细胞/组织细胞的大 B 细胞淋巴瘤（THRLBCL）多见以反应性 T 淋巴细胞和组织 细胞为主的背景，瘤细胞为大 B 细胞，量少，可以出现 R-S 样形态，表达 CD45、CD20，不表达 CD15，免疫 表型结合 IG 基因重排有助于进行鉴别[20]。通过全面分析免疫组化特点和形态学特征并结合 TCR、IG 基因 重排，可与 HL 相鉴别。

3.2.3 实体肿瘤累及骨髓往往伴有骨髓纤维化

转移性肿瘤细胞形态异型性高，核大，深染，巢状聚集。免疫组化广谱 CK 可以很好的与 HL 鉴别。

综上所述，流式细胞学和骨髓细胞形态学一般很难检测出霍奇金淋巴瘤累及骨髓结果，容易发生遗漏 和误诊。骨髓活检联合免疫组化在霍奇金淋巴瘤累及骨髓检出能力远高于骨髓细胞形态学及流式检测，及 时正确的判定对于疾病的进展情况和治疗方案具有重大意义。

本研究属于病理切片回顾性分析，符合国卫科教发（2023）4 号文件规则，可免除伦理审查。

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