摘要:目的 探讨弥漫性大Ｂ细胞淋巴瘤(Diffuse Large B-cell Lymphoma,DLBCL)中MYD88和NAP1L5基因的特征,及其与临床表现和预后之间的关系。方法 分析本院2019年1月至2022年12月期间的87例DLBCL患者中MYD88和NAP1L5基因突变的情况,并分析其与临床特征的关系。评估影响DLBCL患者总生存期的相关因素。结果 87例患者中,31例出现MYD88基因异常,35例出现NAP1L5基因异常。两个基因共异常率为26.43％。MYD88和NAP1L5基因异常及共异常主要集中在ABC型DLBCL中,阳性率分别达74.19％、74.28％、73.91％。在Ⅲ~Ⅳ期病例中,MYD88基因异常和两基因共异常的比例(61.29％、65.21％)均高于Ⅰ~Ⅱ期的病例(Ｐ<0.05)。在IPI指数为3~5的病例中,MYD88基因异常的比例(64.51％)高于IPI指数为0~2的病例(Ｐ<0.05)。生存时间的单因素分析显示,病理分型、临床分期、MYD88、NAP1L5基因异常组和两基因共异常是影响因素。生存分析显示,不同病理分型、临床分期、MYD88 基因状态、NAP1L5 基因状态、MYD88、NAPIL5)。临床分期、MYD88 和 NAP1L5 基因共异常情况患者的生存时间差异显著(P<0.05)。临床分期、MYD88和NAP1L5基因共异常是影响患者总生存期的独立因素（P<0.05）。结论 MYD88、NAP1L5 基因异常与 DLBCL 的临床特征密切相关,临床分期和 MYD88 和 NAPIL5 基因的共异常是影响 DLBCL 患者总生存期的独立因素。

关键词：弥漫性大B细胞淋巴瘤;MYD88基因;NAP1L5基因;临床特征;预后:Cox多因素回归分析

Abstract:Objective To explore the characteristics of MYD88 and NAP1L5 genes in diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL)and their relationship with clinical manifestations and prognosis .Methods The mutations of MYD88 and NAP1L5 among 87 patients with DLBCL in our hospital from January 2019 to December 2022 were analyzed ,and its relationship with clinical features was assessed Factors influencing the overall survival of DLBCL patients were evaluated.Results Among the 87 patients 31 had MYD88 gene abnormalities,and 35 had NAP1L5 gene abnormalities.The co-abnormality rate of the two genes was 26.43%.MYD88 and NAP1L5 gene abnormalities and co-abnormalities were mainly concentrated in ABC-type DLBCL,with positive rates of 74.19%,74.28% and 73.91%,respectively.In stage Ⅲ-Ⅳcases,the proportions of MYD88 gene abnormalities and co-abnormalities ( 61.29% ,65.21% ) were higher than those in stage Ⅰ-Ⅱ cases (P<0.05).In cases with an IPI index of 3-5,the proportion of MYD88 gene abnormalities (64.51%) was:higher than that in cases with an IPI index of 0-2 (P<0.05).Univariate analysis of survival time showed that pathological type,clinical stage,MYD88 ,NAP1L5 gene abnormalities and co-abnormalities were influencing factors.Survival analysis showed significant differences in the survival time of patients with different pathological types,clinical stages,MYD88 and NAP1L5 gene status and co-abnormalities ( P<0.05).Clinical stage and co-abnormalities of MYD88 and NAP1L5 were independent factors influencing the overall survival of patients ( P<0.05).Conclusion MYD88 and NAP1L5 gene abnormalities are closely related to the clinical characteristics of DLBCL.Clinical stage and co-abnormalities of MYD88 and NAP1L5 genes are independent factors affecting the overall survival of DLBCI patients.

Key words: Diffuse large B-cell lymphoma:MYD88 :NAP1L5 : clinical features; prognosis; Cox multivariate regression analysis

弥漫性大Ｂ细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL) 是一种高度异质性的非霍奇金淋巴瘤,是成年人非霍奇金淋巴瘤患者的最大比例。DLBCL患者的临床表现和预后差异显著,这表明该疾病可能涉及多种分子机制。 近年来,基因变异和分子标志物的研究逐渐揭示了DLBCL的潜在复杂性,为了更好地理解和治疗这一疾病,深入研究其分子特征至关重要[1-2]。MYD88( Myeloid differentiation primary response 88 )[3]和 NAP1L5 ( Nucleosome Assembly Protein 1 Like 5)[4]。作为两个关键基因,参与了多种免疫和炎症反应的调控,并在多种恶性肿瘤中显示出异常表达和突变。然而,关于这两个基因在 DLBCL 中的分布特征以及其与患者临床表现和预后之间的关系的研究还相对有限。以往的研究主要集中在 DLBCL的病理学和临床表现,对于基因水平的认识相对较少。因此,深人了解 MYD88 和NAP1L5 基因在 DLBCL 中的突变情况及其与患者的关联,将有助于揭示DLBCL 的分子机制,并为个体化治疗提供有力的支持。本研究旨在通过回顾性分析,系统探讨 MYD88 和 NAPIL5 基因的特征，特别是其与 DLBCL 临床表现和患者预后之间的潜在关系。通过对这两个基因在 DLBCL中的异常表达和突变的深入研究,希望为深化对 DLBCL 发病机制的理解、优化临床诊疗策略以及开发新的治疗靶点提供更为全面和深入的认识。

1.1研究对象

对本院 2019 年1 月至2022 年 12月期间收治的 87 例 DLBCL 患者的临床病案资料进行了回顾性分析。诊断标准:参考《中国版 NCCN恶性淋巴瘤治疗指南》[5] 中的诊断标准。纳入标准包括:(1)经组织病理学确诊为 DLBCL 患者:(2)临床病案资料信息完整;(3) 术前未经放化疗治疗;(4)随访时间≥24 个月,有完整随访资料。排除标准为:(1)合并其他恶性肿瘤;(2)病理组织标本残余组织较少无法满足研究使用:(3)合并严重肝、肾功能异常。研究对象中,男性为 43 例,女性为 44例;年龄范围为 25 至 86 岁,平均年龄为(67.44±7.54)岁。所有患者均签署了知情同意书,本研究得到了医学伦理委员会的批准。

1.2 MYD88、NAP1L5 基因检测方法

取出石蜡包埋的肿瘤组织.采用旋转切片机切片(片厚 4 ~6um),经二甲苯脱蜡,梯度乙醇去二甲苯。随后使用康宁生命科学(吴江)有限公司公司提供的 DNA 提取试剂盒的方法提取核酸,提纯后将其加入PCR 混合液中。用于进行 MYD88 和 NAP1L5 基因的 PCR扩增。MYD88 基因的 PCR 扩增引物序列;Forward引物序列:5'-ATG TCT TCC TCA GCA GCG GCA C-3';Reverse 引物序列:5'-TTA GGT TTC TCG CAT CTT CAC AGG-3'。NAP1L5 基因的 PCR 扩增引物序列:Forward 引物序列:5'-TGA AGC CGA CAGAAG CGA GGA G-3';Reverse 引物序列:5'-TCA GGC CCA GTC ATC CGA GTC C-3'。PCR 反应条件如下:PCR 反应体系为 25 uL,包括 50 ng/uL 的模板 DNA,0.5 uM 的 Forward 引物和 0.5 uM 的 Reverse引物,以及 1.25 units/25 uL 反应体系的 Taq DNA 聚合酶。PCR 反应使用1x PCR 缓冲液和2.0 mM的MgCl2 。PCR 周期数为 30 个周期,每个周期包括 94℃ 的变性步骤(30 s),55℃的退火步骤(30 s),和 72℃的延伸步骤(1 min)。最后进行 72℃的延伸步骤,持续 10 min。扩增后的产物经过纯化后送至上海睿昂基因公司进行双向测序,对于有突变的病例则进行反向测序以确保结果的准确性。具体的操作步骤可参考仪器及相关试剂盒的说明书。

1.3 观察指标

统计患者 MYD88、NAP1L5 基因突变情况;分析 MYD88、NAP1L5 基因突变与患者临床特征[病理分型、发病部位、临床分期、国际预后指数(IntI ernational Prognostic Index,IPI)、全身症状]的关系。安排专门的数据管理员负责统计数据库中的临床信息.从患者的电子病历中提取所需的临床特征,按照事先制定的数据收集表格或数据库字段逐项提取数据，并确保准确性。在数据提取过程中，实施双重检查机制,确保数据的一致性和完整性。从临床特征、MYD88、NAP1L5 基因突变及共异常情况方面分析影响 DLBCL 患者总生存期的单因素( 随访时间不少于 24 个月),将单因素分析中存在统计学意义的变量纳入 Cox 多因素回归分析中。

1.4 统计学分析

采用 SPSS 25.0 统计学软件进行数据分析。对于正态计量数据,采用“均数±标准差”表示;非正态数据采用中位数和上下四分位数表示,计数资料则以例数和百分比 n(%)表示。两组样本率的比较采用卡方检验:两组中位生存时间的比较采用 Log Rank 检验。对于单因素分析中具有统计学意义的结果,进行 Kaplan -Meier 生存分析,并将其引入多因素分析中。多因素分析将运用Cox 回归模型。P<0.05 为差异有统计学意义。

２.１MYD88、NAP1L5基因突变情况

87例 DLBCL患者中,MYD88基因异常31例(35.63％),其中20例扩增,11 例易位;NAP1L5 基因异常 35 例(40.23%)其中25 例扩增,10 例易位。MYD88、NAP1L5 基因共异常 23例( 26.43%),MYD88、NAP1L5 基因非共异常 64 例( 73. 56% ) 。

2.2 MYD88、NAP1L5 异常与临床特征的关系

MYD88 和 NAP1L5 基因异常及共异常主要集中在ABC 型 DLBCL 中,阳性率分别达 74.19%、74.28%、73.91%,而在 GCB 型中阳性率仅为 25.8%、25.71%、26.08%,差异有统计学意义( P<0.05)。在 III~IV期病例中,MYD88 基因异常和两基因共异常的比例( 61.29%、65.21%)均高于I~II 期的病例( P<0.05)。在 IPI 指数为 3~5 的病例中,MYD88 基因异常的比例(64.51%)高于 IPI 指数为 0~2 的病例(P<0.05)。见表 1。

2.3 影响患者总生存期的单因素分析

87 例患者生存时间 8~39 个月,中位生存时间 23( 15~28)个月。随访时间 24~40 个月,中位随访时间 26( 24~31)个月。由表 2 中的数据可知,ABC 型患者的生存期短于 GCB 型患者( P<0.05);Ⅰ~Ⅱ期患者的生存期显著长于Ⅲ~IV 期患者( P<0.05 );MYD88、NAP1L5 基因异常组和两基因共异常者的生存期均显著短于相应正常者( P<0.05)。

Kaplan-Meier 生存分析结果显示,不同病理分型(ABC 型GCB 型)、临床分期(I~II 期、III~IV期)、MYD88 基因状态(异常、正常) NAP1L5 基因状态(异常、正常)、MYD88、NAP1L5 基因共异常情况(共异常、非共异常)患者的 Log Rank 卡方值分别为 7.035、20.825、45.765、24.243、97.736,P< 0.05。由此可知,这些因素对生存曲线的影响是显著的，见图 1。

2.4 患者生存时间的 Cox 多因素回归分析

将单因素分析中存在统计学意义的变量纳入 Cox 多因素可归分析中，经 Omnibus 检验结果显示，卡方值为100.663，P<0.05。由此可知,该 Cox 多因素回归分析中，自变量的联合作用是显著的。表 3 中的数据显示,临床分期、MYD88 和 NAP1L5 基因共异常是影响患者总生存期的独立因素( P<0.05),即临床分期越高,生存时间越短:MYD88 和 NAP1L5 基因共异常情况越显著,生存时间越短。